液氮保存胚胎腦組織與移植的實驗研究

　　一、實驗方法

　　正常妊娠15～21天的SD大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，在無菌條件下剖腹取胎，切取所需胎腦組織，制成1mm大小的組織塊。用吸管將其移入含10%二甲基亞砜(DMSO)的無血清DMEM培養(yǎng)液中，裝進凍存管，于4℃平衡1小時后置入-30℃冰箱。約1小時后標本溫度降至-30℃(降溫速率為0.5℃～1.0℃/分)，然后放入液氮中保存。需要時，取出凍存管于37℃水浴中復溫，冰塊熔化后再用Hank液以1∶1比例對凍存液反復稀釋4次，每次3分鐘。此時即可用于檢測和移植。細胞存活率檢測先采用胰酶消化制成細胞懸液，用0.4%臺盼藍染色1分鐘，再按血球計數(shù)方法對死活細胞分別計數(shù)，求出細胞存活率。腦內(nèi)組織移植分A、B兩組進行，每組12只，分別進行新鮮組織移植和保存組織移植。兩種組織均取自胎鼠頂葉，前者離開母體時間不超過20分鐘，后者在液氮中保存30天。采用左頂葉皮層切開移植，每次植入3～5塊組織。飼養(yǎng)6～8周后處殺，取腦，連續(xù)石蠟切片，進行HE、Nissl和嗜銀染色。

　　二、結(jié)果

　　細胞存活率觀察：不同部位組織在液氮中保存10天和30天，細胞存活率(%)大腦組織為67.78±4.46和65.14±4.55，小腦組織為68.93±5.67，腦干組織為71.07±7.43和69.63±1.99。經(jīng)方差分析，三種組織之間細胞存活率差別不顯著(P>0.05)，不同保存時間之間細胞存活率差別也不顯著(P>0.05)。

　　腦內(nèi)移植組織學觀察：A組移植物成活例數(shù)7/12，移植物位于皮層下或伸入側(cè)腦室，體積較大，周邊有薄層膠質(zhì)細胞反應帶。移植物內(nèi)是均勻分布的大型神經(jīng)元和少量散在的膠質(zhì)細胞。神經(jīng)元核大，染色淡，核仁清楚，并可見到雙核仁細胞，胞漿中尼氏小體豐富。移植物內(nèi)有新生血管結(jié)構(gòu)及比較致密的神經(jīng)纖維網(wǎng)，在交界面上也有少量神經(jīng)纖維。B組移植物成活例數(shù)2/10(2例感染不計)，移植物位于皮層下，體積小，呈散在的細胞團樣，神經(jīng)元核大淡染，胞漿不豐富。移植物內(nèi)也可見到血管內(nèi)皮細胞，嗜銀染色見移植物中神經(jīng)纖維稀少。

　　三、討論

　　本實驗考察了兩步法梯度降溫液氮保存胎腦組織的可能性。此法保存大鼠胎腦組織10天和30天平均細胞存活率在60%～70%。將新鮮的和保存30天的組織植入同種大鼠腦內(nèi)，組織學檢查發(fā)現(xiàn)兩組都有移植物成活，但是與新鮮組織移植相比，保存的組織移植后移植物體積小，神經(jīng)元數(shù)量少，胞漿不豐富，移植物內(nèi)神經(jīng)纖維少見，表明神經(jīng)元分化較差。結(jié)果提示，用兩步法梯度降溫液氮保存胎腦組織可取得較高的細胞存活率，移植后也有一定的成活率，但是移植物成活質(zhì)量明顯不如新鮮組織移植。所以，這種保存方法能否實際應用還值得討論和進一步研究。查特液氮罐